原代細胞是從人或動物供體組織直接分離，經機械/酶消化成單細胞或混合細胞群，在體外模擬生理環境（無菌、37℃、5%CO?、定制培養基）中短期存活并有限增殖。需通過差速貼壁或抑制劑純化目標細胞，廣泛應用于藥物測試、分化研究及病毒宿主機制分析。
原代細胞培養的注意事項
（1）無菌操作：無菌操作是原代細胞培養成功的基石。細菌與霉菌污染占失敗案例的80%以上，需以預防為核心：操作前紫外消毒≥30分鐘+器械乙醇浸泡；取材后立即雙抗漂洗；培養基添加抗生素僅作臨時防護（如0.5%Primocin）。污染后難以徹底清除，因細菌生物膜、支原體穿透性及霉菌孢子抗性均可能導致細胞報廢，需廢棄污染樣本并徹底環境消殺。
（2）培養基：培養基需滿足細胞營養、滲透壓（哺乳類260–320mOsm/kg）及pH（7.2–7.4）等生存條件。因物種與組織差異（如神經元用Neurobasal+B27，昆蟲細胞用MGM-448），需通過預實驗篩選配方：測試細胞增殖速度、貼壁率及形態穩定性，并驗證血清批次適用性。添加生長因子（如bFGF）或抑制劑（如BrdU）時，需定制濃度；無血清培養基適用于特定分泌實驗。
（3）小牛血清：胎牛血清（或優質新生牛血清）對維持細胞存活及增殖至關重要，其白蛋白、轉鐵蛋白和生長因子是核心功能成分。需預篩選至少3個批次：通過細胞增殖率（CCK-8法）、貼壁率及無污染檢測（如支原體PCR）綜合評估；選定批次后應分裝凍存、避免反復凍融，并全程用于同一項目。若需切換批次，需交叉培養驗證細胞適應性72小時。
（4）膠原酶溶液：膠原酶溶液需新鮮配制，因凍存（含-80℃）會導致酶空間結構解折疊，活性不可逆衰減。若需保存，應分裝避光存于-80℃且≤2周。消化時需實時監控組織狀態，延長消化時間將加劇細胞膜損傷與代謝紊亂。
（5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細胞對其有高需求，是合成核酸/蛋白質的關鍵底物及能量來源，缺乏會導致生長停滯甚至死亡。但其降解產物氨（NH?）具有強毒性（>2mmol/L即抑制代謝），建議：
單獨分裝后-20℃凍存，避免反復凍融；
使用前臨時加入培養基；
4℃保存超過7天需補加全量，若培養基變黃（pH>7.6）則廢棄換新液；
對氨敏感細胞（如神經元），優先選用丙氨酰-谷氨酰胺替代品。
（6）靜置培養：消化分離后的初期（24-72小時）需保持培養環境穩定，避免物理擾動。但需每日遠程監測培養基顏色（pH）、CO?濃度及溫度。若培養基變黃或出現懸浮顆粒，應立即終止靜置；對包被依賴性細胞（如神經元），靜置前需進行基質預涂布。
（7）消化時間：通常消化至肉眼可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已松散，稍加吹打即可形成細胞團或單個細胞，過長的消化時間往往導致細胞損傷加重，細胞培養成活率降低。
（8）生長因子：經消化、貼壁等常規處理后，原代細胞培養仍需針對性添加生長因子。例如胰島素可增強代謝底物攝取；EGF、bFGF等能促進有絲分裂，但成本較高。特殊類型細胞（如神經元、干細胞）還需組合特定因子（如VEGF、KGF）以維持功能。
原代細胞培養的成功，依賴于無菌操作、培養基定制、血清篩選等環節的精準協同調控。未來需推動無血清培養基降低批次差異，結合自動化監測優化消化終點。其核心價值在于構建個體化疾病模型及精準藥物篩選平臺，但需同步突破傳代極限并完善倫理規范。
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