ELISA外源性干擾物質會影響抗體和抗原結合，導致分析物濃度假高或假低，從而導致結果不準確。這些干擾物質非目標分析物，可能來自各種外源，例如樣品處理不當，或存在于患者血液中，例如脂質、膽紅素或血紅蛋白。了解這些干擾因素對于準確的診斷和治療至關重要。
標本溶血
血紅蛋白中的血紅素基因有類似過氧化的活性，如果以辣根過氧化物酶（HRP）為標記酶的酶聯免疫吸附實驗（ELISA）中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，其在溫育過程就會被吸附在固相，從而在后面加入的HRP和底物反應顯色和發光，導致假陽性結果。
如何避免這種影響
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保證樣本質量：這是最重要的一步。在采集和處理血液樣本時，要盡量輕柔，避免劇烈震蕩或反復凍融，以防止溶血。離心得到的血清或血漿應該是清澈淡黃色的，而不是粉紅色或紅色。
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充分洗滌：ELISA實驗中的洗滌步驟至關重要。充分的洗滌可以洗掉未結合的物質，包括那些非特異性吸附在孔板上的血紅蛋白，從而降低背景信號。
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設置合適的對照：設置不加一抗或二抗的空白對照孔，如果這些孔也出現了明顯的顏色，則很可能是由樣本中的內源性類過氧化物酶（如血紅蛋白）活性引起的。
樣本被細菌污染
如果樣本被細菌污染，這些細菌可能含有內源性的過氧化物酶/過氧化氫酶就會成為一個嚴重的干擾源，在ELISA實驗中產生非特異性顯色，進而干擾測定結果，造成假陽性。
如何避免這種影響：
在加入HRP標記的抗體之前，用3%的過氧化氫(H?O?)溶液處理樣本/固相載體（如ELISA板、IHC切片）10-15分鐘，然后用緩沖液（如PBS或PBST）徹底洗滌。
樣本保存不當
如果樣本保存不當，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體。在ELISA實驗中，尤其是間接ELISA法，IgG聚合體和內源性酶會導致本底過深，AFP二聚體會導致結果偏低。
如何避免這種影響：
樣本保存合適的溫度，避免樣本反復凍融，在進行ELISA實驗可以做對照
標本凝集不全
在進行臨床實驗中，血液還未開始凝固時候強行離心分離血清，此時血清仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA檢測中容易造成假陽性結果。
如何避免這種影響：
血液樣本收集后，應在室溫下靜置一段時間（例如30-60分鐘），待其完全凝固后，再通過離心分離上清，即可獲得血清。
樣本管中添加物質
抗凝劑（如肝素、EDTA）、酶抑制劑（如NaN3）及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。例如，肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、NaN3可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性，從而影響檢測結果，可能導致假陰性。
如何避免這種影響：
遵循說明選對樣，規避干擾做好驗證。
樣本中存在的內源性及外源性干擾物質，對ELISA實驗結果的準確性具有決定性影響，甚至可以使整個實驗功虧一簣。因此，透徹理解這些干擾因素的作用機制，是避免出現假陽性、假陰性等各種錯誤結果，確保數據真實可靠的根本前提。
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