61-90-5 / L-亮氨酸的發酵生產方法

背景及概述^[1]

L-亮氨酸(L-leucine)又稱白氨酸，即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基異己酸，分子式為C6H13O2N。1819年Proust首先從奶酪中分離得到，后來Braconnot從肌肉與羊毛的酸水解物中得到結晶，并定名為亮氨酸。亮氨酸與纈氨酸、異亮氨酸同屬于支鏈氨基酸，是人體八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸具有多種生理功能，在醫藥、食品、化妝品、農業等方面應用廣泛。

制備^[1]

一種發酵生產L-亮氨酸的方法

(1)活化培養：取L-亮氨酸生產菌(即谷氨酸棒桿菌ACCC16522，購自上海復祥生物科技有限公司)接種至活化培養基上，在培養箱中32℃活化培養12h，得到活化菌。

活化培養基：無水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl2.5g/L、瓊脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2。

(2)種子培養：取一環生長良好的活化菌接種至含有種子培養基的搖瓶中進行種子培養，裝液量為200mL/500mL，種子培養的條件為32℃，150r/min搖床培養20h，用分光光度計測定發酵液中的菌體濃度，菌體OD620值達到1.2可作為合格的種子液，得到種子液。

種子培養基：無水葡萄糖20g/L、玉米漿干粉25g/L、硫酸銨2g/L、KH₂PO₄·3H₂O1.5g/L、維生素B1 300μg/L、生物素200μg/L，pH＝7.0-7.2。

(3)發酵培養：按照10％的接種量，取步驟(2)得到的種子液，接種至含有發酵培養基的10L發酵罐中，裝液量為6L/10L，培養溫度為30℃-35℃，攪拌轉速600rpm/min，在培養過程中加入補料培養基，前12h的通氣量為80-100L/h，12h之后的通氣量為100-120L/h，通過自動流加氨水控制發酵過程中pH＝6.6±0.05，培養30-32h，得到發酵液。發酵結束時間以產酸不再增加為判斷標準。發酵培養前后，用高效液相色譜法測定L-亮氨酸含量；利用生物傳感分析儀檢測發酵液殘糖的含量。

發酵培養基：蘋果酸鈉2.0-4.0g/L、無水葡萄糖140-160g/L、玉米漿干粉35g/L、硫酸銨20g/L、KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、MnSO₄·H₂O 0.1g/L、維生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO₃ 30g/L、消泡劑0.5％，pH＝7.0-7.2。

補料培養基：蘋果酸鈉1.0g/L、肌醇1.0-2.0g/L、玉米漿干粉12g/L、硫酸銨25g/L、KH₂PO₄·3H₂O 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.6g/L、MnSO₄·H₂O 0.3g/L、維生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO₃ 20g/L、消泡劑1.0％，pH＝7.0-7.2。

(4)L-亮氨酸的提取：取發酵結束后的發酵液，8000r/min離心10min，收集上清液，將上清液過離子交換柱提取純化，0.5BV/h流速上樣，上樣量為260mL的發酵液，所用洗脫劑為3.0mol/L的氨水，洗脫流速為0.1-1.0BV/h，收集流出液，用高效液相色譜法測定發酵液和流出液中L-亮氨酸的含量，計算得率。

參考文獻

[1] [中國發明,中國發明授權] CN201910065390.3 一種發酵生產L-亮氨酸的方法