手機(jī)掃碼訪問(wèn)本站
微信咨詢
秋水仙素是從百合科植物秋水仙的鱗莖和種子中提煉出來(lái)的一種植物堿。一般商品為淡黃色粉末，味苦，融點(diǎn)155℃，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，在熱水中溶解度較差，不易溶于苯和乙醚。1889年佩爾尼切首先發(fā)現(xiàn)了秋水仙素對(duì)有絲分裂產(chǎn)生的影響，他描述 了狗腸胃內(nèi)壁細(xì)胞的分裂中期被秋水仙素所阻抑，紡錘體被破壞，染色體行動(dòng)癱瘓，不正常的有絲分裂細(xì)胞大量停留在中期。這種由秋水仙素引起的不正常的分裂稱秋水仙素有絲分裂(簡(jiǎn)稱C有絲分裂)。在核型分析和多倍體的誘變中，
秋水仙素是一種應(yīng)用最廣泛的化學(xué)藥劑。其水溶液的濃度和它的作用效力成正相關(guān)，濃度越高，作用越強(qiáng)。各種植物和不同組織對(duì)秋水仙素有不同的反應(yīng)。概括地說(shuō)，對(duì)幼嫩而分裂 迅速的組織(如萌動(dòng)種子的胚芽)處理時(shí)間可較短，濃度應(yīng)低些;反之處理時(shí)間可長(zhǎng)些，濃度應(yīng)高些。秋水仙素處理的有效濃度為0.01～0.4%，而以0.2%左右的應(yīng)用范圍最廣。如將濃度為 0.2～0.4%的秋水仙素溶液滴在二倍體西瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)上，每日一次，連續(xù)4天，并遮陰保持濕度，即可誘導(dǎo)四倍體西瓜。對(duì)于谷類作物，如水稻，則可將有四片以上真葉的健壯秧苗在根頸處割一切口，以不割傷生長(zhǎng)點(diǎn)為度，浸入0.025～0.05%的秋水仙素溶液中，淹沒(méi)切口，經(jīng) 8～14天(20℃)也可得四倍體植株。目前秋水仙素廣泛用于花藥(粉)、子房培養(yǎng)的所得單倍體植株的染色體加倍。秋水仙素毒性很大，能引起眼睛的暫時(shí)失明，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻痹并引起呼吸困難，使用應(yīng)注意安全。
選育玉米自交系的常規(guī)方法，育成一個(gè)自交系至少需要經(jīng)過(guò)7代以上的連續(xù)自交，對(duì)于遺傳背景復(fù)雜的材料甚至要10代以上。為了加快自交系的選育速度，縮短育種周期和提高純度，國(guó)內(nèi)外通常采用的方法主要有：秋水仙素誘導(dǎo)法。
在玉米吐絲期，用秋水仙素作為染色體加倍處理劑處理花絲，使其不經(jīng)過(guò)雙受精而是通過(guò)孤雌生殖直接產(chǎn)生純合的二倍體種子。秋水仙素是常用的染色體加倍處理劑，其突出優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)率高，因此在教學(xué)和科研中被廣泛使用。然而，盡管秋水仙素誘導(dǎo)玉米孤雌生殖已是一種成熟的玉米自交系選育技術(shù)。但是該方法存在的兩大問(wèn)題，使其難以在育種上規(guī)模化應(yīng)用：一是安全問(wèn)題。秋水仙素屬于劇毒試劑，致癌性強(qiáng)。為了盡量避免與人體接觸，現(xiàn)有技術(shù)均采取涂抹花絲或向花絲注射的方法。但涂抹時(shí)極易造成刮碰和藥液滴落，注射時(shí)由于花絲間的空隙很小，用量難以掌握，極易造成藥液溢出和流淌。因此，對(duì)人體健康威脅很大。二是花粉污染問(wèn)題。處理時(shí)，即使在嚴(yán)格的套袋條件下操作，或遮擋，或避開散粉時(shí)間，但花粉污染問(wèn)題仍很嚴(yán)重，產(chǎn)生大量假種子，特別是在海南氣候條件下。此外，由于花絲生長(zhǎng)緊密，注射時(shí)對(duì)藥液的容納量很少，一部分花絲不容易接觸到藥液；又由于花絲親水性差，涂抹時(shí)不容易附著，難以達(dá)到理想的處理效果；為了保證安全，操作要求極其嚴(yán)格。因此，處理動(dòng)作謹(jǐn)慎，速度慢、效率低，也是造成不能規(guī)?；瘧?yīng)用的原因。
CN201410405142.6采用的技術(shù)方案如下：
1.誘導(dǎo)劑配制
配制常規(guī)的秋水仙素(COL)誘導(dǎo)劑，或以秋水仙素為主與二甲基亞砜(DMSO)、 青鮮素(MH)復(fù)配而成的誘導(dǎo)劑。
2.誘導(dǎo)前果穗處理
在吐絲前對(duì)雌穗套袋；待花絲完全吐出時(shí)摘掉紙袋，在雌穗花苞由頂部向下接近雌穗幼穗的位置橫向切掉部分花苞。呈現(xiàn)中間是花絲，周圍是苞葉的圓形斷面；用弧形刻刀在斷面上切掉一截花絲，切割的深度為8—15mm，做到既切掉花絲又不切漏周圍的苞葉，即在斷面上形成深度為8—15mm的空洞。
3.注入誘導(dǎo)劑
為防止藥劑與人體接觸，將誘導(dǎo)劑裝入封閉嚴(yán)密的器具如移液槍或注射器。之后向空洞內(nèi)注入誘導(dǎo)劑，充滿且藥液覆蓋或潤(rùn)濕整個(gè)斷面為止。最后將紙袋套回，完成處理過(guò)程。
由于花粉遇到處理液后會(huì)因吸收藥液而膨脹死亡，斷面上即使有花粉落入也不會(huì)造成任何污染。因此，徹底解決了花粉污染問(wèn)題，確保種子真實(shí)可靠。處理時(shí)，不需要密封、遮擋或隔離，整個(gè)過(guò)程在完全開放條件下自由操作。
4.收獲與繁殖
種子成熟時(shí)收獲，即得到基因型純合的二倍體種子；下一季播種，套袋自交，根據(jù)表型進(jìn)行真?zhèn)魏蛢?yōu)劣鑒定，選擇優(yōu)良植株，得到單穗。并可以其作父本在此代提前測(cè)配；將收獲的果穗繼續(xù)播種下一代，種成穗行,根據(jù)植株、果穗、籽粒等性狀的一致性鑒別出純合穗行，選擇符合育種目標(biāo)的穗行收獲，即獲得純合的玉米自交系?？稍诖舜M(jìn)行大量測(cè)配。
本方法的積極效果如下：
1.解決了使用秋水仙素的安全問(wèn)題
采用橫斷面挖洞施藥，避免了現(xiàn)有技術(shù)由于涂抹時(shí)導(dǎo)致的刮碰和藥液滴落，注射時(shí)的藥液溢出、流淌等對(duì)人體健康造成的威脅。
2.解決了現(xiàn)有技術(shù)的花粉污染問(wèn)題
由于處理液淹沒(méi)了全部花絲的頂部及覆蓋整個(gè)切面，即使有花粉飄落也會(huì)由于花粉遇到處理液后吸水而膨脹死亡，徹底解決了現(xiàn)有技術(shù)中難以解決的花粉污染問(wèn)題。
3.可在完全開放條件下自由操作
誘導(dǎo)處理時(shí)不需要在套袋、遮擋、空間隔離區(qū)或時(shí)間隔離條件，可以在完全開放 條件下和在任何時(shí)間里自由操作。
4.適合規(guī)模化應(yīng)用
由于使用安全、程序簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單容易，并且不受隔離區(qū)限制，因此可規(guī)模化應(yīng)用。
5.誘導(dǎo)率提高
既利用了秋水仙素誘導(dǎo)率高的優(yōu)勢(shì)，又保證所有花絲都能與藥液接觸，還使藥液停留時(shí)間延長(zhǎng)，因而誘導(dǎo)率提高。
6.節(jié)省藥液
藥液集中，且不流淌浪費(fèi)。現(xiàn)有的秋水仙處理技術(shù)一般每穗需藥液2ml左右，而此方法僅需1ml左右，可節(jié)省藥液50％左右，降低了用藥成本。
7.程序簡(jiǎn)單
直接形成二倍體種子。與Stock 6誘導(dǎo)單倍體技術(shù)相比，一是不需要染色體加倍過(guò)程；二是不需要當(dāng)代種子鑒別；三是不存在種子鑒別困難等問(wèn)題。
8.選育速度快
比常規(guī)玉米自交系選育方法的選育周期縮短5代以上。由于可確保誘導(dǎo)結(jié)籽的真實(shí)性以及誘導(dǎo)第一代植株能正常散粉，因此從誘導(dǎo)第一代開始就可以其作父本進(jìn)行提前測(cè)配，雜交種選育速度比Stock 6誘導(dǎo)單倍體技術(shù)還要提前1代。
用于培育一種同源四倍體七葉一枝花植株。通過(guò)此方法可快速實(shí)現(xiàn)同源四倍體七葉一枝花植株的培育，進(jìn)而有效提高其活性成分的含量，克服七葉一枝花在自然繁殖和人工種植中出現(xiàn)的品種退化問(wèn)題。步驟如下：
(1)繁育組培苗：取性狀優(yōu)良的七葉一枝花植株的葉芽，通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)，繁育 出組培苗(該步所涉及的技術(shù)為常規(guī)技術(shù))；
(2)秋水仙素處理：用以下兩種方法之一處理：
①在無(wú)菌條件下，選取生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的組培繼代苗，在莖部造成若干(2～5個(gè))創(chuàng)傷(所述創(chuàng)傷是指用器械輕輕劃傷)，然后用脫脂棉包裹嚴(yán)密，再在脫脂棉上滴入質(zhì)量濃度為0.03％～ 0.05％的秋水仙素溶液浸潤(rùn)，在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～15天后，用無(wú)菌水洗凈，切成單芽后 轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
②將組培苗轉(zhuǎn)接至添加質(zhì)量濃度為0.05％～1.0％的秋水仙素的分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～30天后，切成單芽轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
所述分化培養(yǎng)基的組份組成為：MS+BA 0.5～0.8mg/L+GA3 0.1～0.5mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+CTK(細(xì)胞分裂素)0.3～0.5mg/L(即：向MS培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5～0.8mg/L的BA、0.1～0.5mg/L的GA3、0.1～0.3mg/L的NAA以及0.3～0.5mg/L的CTK而成；該表 述方式為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員慣用的表述方式；下同；所述MS培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)中常用的培養(yǎng)基)；
所述在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度25～30℃，每天日照8～12h，光照強(qiáng)度 60μmol·m-2·s-1；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分組成為：MS+BA 1.5～2.0mg/L+GA3 0.1～0.5mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖20～30g/L；
(3)誘導(dǎo)植株分化培養(yǎng)：在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～35天，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，培養(yǎng)條件為：溫度20～30℃，每天日照8～12h，光照強(qiáng)度120μmol·m-2·s-1；
(4)誘導(dǎo)植株增殖培養(yǎng)：將上述長(zhǎng)出的叢生芽轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中，在溫度20～30℃，每天日照8～12h，光照強(qiáng)度120μmol·m-2·s-1的條件下，培養(yǎng)25～35天，將叢生芽分株培養(yǎng)成完整植株；所述增殖培養(yǎng)基的組分組成為：MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+蔗糖20～30g/L；
(5)誘導(dǎo)植株染色體檢測(cè)：切取步驟(4)中得到的完整植株，在解剖鏡下剝離莖尖， 經(jīng)過(guò)壓片染色，在顯微鏡下進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)；
(6)選育同源四倍體植株：通過(guò)染色體數(shù)目檢測(cè)，篩選出四倍體植株，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃，每天日照8～12h，光照強(qiáng)度120μmol·m-2·s-1的條件下，培養(yǎng)25～35天，即培育出同源四倍體完整植株；
[1] 科學(xué)技術(shù)社會(huì)辭典·生物
[2]CN201410405142.6 一種用秋水仙素誘導(dǎo)玉米孤雌生殖的處理方法
[3]CN201410445856.X 同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法