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羥苯磺酸鈣（CaD）作為血管保護性藥物，具有抗炎、抗氧化、抗血管再生作用，在臨床中被廣泛用于治療糖尿病微血管并發癥，包括糖尿病視網膜病變（DR）、糖尿病腎病（DKD）等。臨床研究發現，羥苯磺酸鈣可減少DKD患者蛋白尿，但其具體機制是什么？天津醫科大學朱憲彝紀念醫院陳莉明教授團隊開展的一項基礎研究對此進行了深入探索，研究成果發表于Frontiers in Pharmacology雜志[1]。
近期有研究證實，糖尿病腎病患者的腎組織中多種細胞的自噬水平異常、血管內皮生長因子（VEGF）與VEGF受體病理性表達增多、PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化水平異常升高與白蛋白尿的產生有緊密聯系。羥苯磺酸鈣作為微血管保護劑，改善DKD的機制究竟是什么？基于此疑問，特開展本研究來探討羥苯磺酸鈣對糖尿病小鼠白蛋白尿的作用，探究其對小鼠腎臟內自噬活性的作用，同時證明其可能作用的信號通路。
該研究應用KK-Ay自發性糖尿病小鼠和HFD/STZ誘導糖尿病小鼠DKD模型，分別取半數小鼠給予羥苯磺酸鈣試劑灌胃治療12周，其余小鼠以同樣方式給予純水灌胃12周，C57BL/6小鼠作為空白對照組。觀察指標及檢測方法包括：
1.一般情況及生化指標：包括空腹血糖、尿微量白蛋白排泄率（UAE）、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉氨酶等；
2.組織形態學：通過HE染色、PAS染色、Masson染色方法檢測腎小球及腎小管間質的組織形態學變化，并測算腎小球平均容量；
3.免疫組化方法檢測足細胞結構性蛋白Nephrin和Podocin的表達情況；
4.免疫組化和Western blot凝膠電泳實驗用于檢測腎組織中自噬相關蛋白（LC3、ATG-5、Beclin-1、P62）在腎組織中的表達情況；
5.Western blot方法檢測小鼠腎臟中VEGF及其受體2、PI3K/AKT/mTOR自噬相關通路磷酸化蛋白與總蛋白的相對表達情況。
總的來說，該實驗的設計思路就是通過觀察蛋白尿變化→腎結構變化→蛋白尿生成的關鍵細胞→影響蛋白表達的通路，層層遞進、抽絲剝繭，揭示羥苯磺酸鈣的可能機制。
01.羥苯磺酸鈣顯著降低DKD小鼠的蛋白尿
在兩種糖尿病腎病小鼠模型中，羥苯磺酸鈣治療均可顯著減少DKD小鼠升高的尿白蛋白排泄率：KK-Ay小鼠和HFD/STZ小鼠中，UAE（μg/24h）分別為7.11 vs. 11.23和0.37 vs. 2.13（均P<0.05）。
而且，羥苯磺酸鈣治療后的DKD小鼠空腹血糖、體重、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉氨酶與未治療的小鼠相比無明顯差異（均P>0.05），提示羥苯磺酸鈣對糖脂代謝等無明顯影響。
02.羥苯磺酸鈣減輕腎組織破壞
DKD小鼠腎臟組織中結構模糊，腎小球結構不規則、體積增大，腎小管上皮細胞排列紊亂，近段腎小管呈空泡樣變性，細胞核形態不一，系膜區膨脹，腎小球與腎小管間質中的纖維化明顯。經羥苯磺酸鈣治療后，DKD小鼠腎臟組織中上述組織形態變化有明顯改善。
03.羥苯磺酸鈣保護足細胞，修復濾過膜損傷
一旦足細胞結構受損，腎小球濾過膜的屏障就會被破壞，蛋白漏出而產生蛋白尿。Nephrin和Podocin作為足細胞特異性蛋白，其表達情況可反映濾過膜結構和功能是否正常。
DKD小鼠的腎組織中，Nephrin和Podocin的表達含量下降，提示濾過膜損傷嚴重。羥苯磺酸鈣治療組小鼠的腎組織中，Nephrin和Podocin的表達含量明顯恢復（P<0.05），提示羥苯磺酸鈣對足細胞的結構具有一定的保護作用，可修復濾過膜損傷。
04.羥苯磺酸鈣恢復DKD小鼠腎臟自噬活性
自噬是真核細胞循環利用的一個關鍵過程，以處理各種應激條件下的分解產物和無用物質，從而維持細胞內穩態。近年來研究表明，糖尿病小鼠出現蛋白尿通常伴有足細胞特異性自噬缺陷。自噬的藥理學誘導對于改善糖尿病患者腎功能具有很好的治療潛力。
該實驗結果進一步確定了DKD進展過程中發生的自噬改變，并驗證羥苯磺酸鈣的確可改變自噬。與DKD小鼠相比，經羥苯磺酸鈣治療后的小鼠LC3、Beclin-1、ATG-5自噬相關蛋白在腎小球和腎小管間質內的表達含量顯著增多，P62蛋白表達降低（P<0.05），提示自噬水平恢復。
05.羥苯磺酸鈣降低VEGF和VEGFR-2表達，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路
在高血糖等應激條件下，VEGF及其受體2（VEGFR-2）過度表達，可通過誘導血管生成和血管通透性增加進而導致腎損傷。該研究證實，羥苯磺酸鈣可降低DKD小鼠腎臟中增多的VEGF與VEGFR-2表達含量（P<0.05）。
PI3K/AKT/mTOR信號通路作為VEGFR-2下游的信號通路之一，其在高血糖時磷酸化水平增高。本實驗進一步發現，經羥苯磺酸鈣治療后，該通路磷酸化水平明顯下降（P<0.05），提示該藥可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑來下調VEGF/VEGFR-2的活化以及恢復自噬水平。
根據以上結果，構建出羥苯磺酸鈣干預的假設路徑如下。
從研究意義看羥苯磺酸鈣的臨床應用
DKD是糖尿病的主要微血管并發癥之一，也是導致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要因素。迄今為止，DKD尚無治愈策略，因此迫切需要探索其發病機制，開發出特異性的有效治療方法。腎損傷可由多種因素導致，微血管病變被認為是主要病理生理機制，因而維持DKD早期微血管的結構和功能，減少蛋白尿，對保護腎功能至關重要。
既往研究已證實羥苯磺酸鈣能減少DKD患者的蛋白尿，但知其然也要知其所以然，有必要對其相關機制進行深入探討。本研究首次證明，在KK-Ay小鼠和HFD/STZ誘導的糖尿病小鼠中，羥苯磺酸鈣通過VEGF/PI3K/Akt/mTOR通路恢復自噬，減少蛋白尿。這為羥苯磺酸鈣的臨床獲益提供了新的理論基礎。
實際上，羥苯磺酸鈣最早用于DR的治療，但DR和DKD通常相伴發生，兩者的發病機制也有相似之處。羥苯磺酸鈣能同時治療DR和DKD，起到“一石二鳥”的作用，對糖尿病患者來說非常有意義。
臨床實踐中，無論是DR還是DKD，均應重視早期篩查，早發現、早干預對于預防疾病進展至關重要。在疾病早期階段就起始羥苯磺酸鈣，可更好地發揮藥物的視網膜和腎臟保護作用。此外，基于臨床研究和實踐經驗，該藥對微血管的修復作用需要一段時間的積累，病情改善通常至少需要3個月至半年，甚至更長時間。由于隨著病程延長，DR和DKD病情也在不斷進展，微血管保護劑的治療也應長期堅持，即早期起始、全程應用，以使藥物盡可能發揮出最佳保護作用。
本實驗證實，在糖尿病腎病小鼠體內，羥苯磺酸鈣通過恢復自噬水平，降低腎小球濾過膜通透性，從而顯著減少白蛋白尿的產生，此作用可能與羥苯磺酸鈣抑制了VEGF/VEGFR-2和PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。這次探索進一步揭示了羥苯磺酸鈣的作用機制，在知其所以然之后，臨床早期、全程應用微血管保護劑的策略就有了更堅實的理論基礎。
參考文獻：1. Wang Y, Lu YH, Tang C, Xue M, Li XY, Chang YP, Cheng Y, Li T, Yu XC, Sun B, Li CJ, Chen LM. Calcium Dobesilate Restores Autophagy by Inhibiting the VEGF/PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2019 Aug 9; 10: 886. doi: 10.3389/fphar.2019.00886.