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本文主要闡述采用補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)提高大腸桿菌TRFC生產(chǎn)L-蘇氨酸的產(chǎn)量。從結(jié)果來(lái)看，L-蘇氨酸與蔗糖的最佳初始比例為70g/L。
通過(guò)利用5L管式發(fā)酵罐進(jìn)行葡萄糖濃度和三種不同的投料方式對(duì)L-蘇氨酸生產(chǎn)的研究。結(jié)果表明：葡萄糖濃度在5-20g/L范圍內(nèi)時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)增強(qiáng)。另外C/N比也是影響L-蘇氨酸產(chǎn)量的主要因素。硫酸銨和蔗糖的最佳配比為30g/g。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，38h后L-蘇氨酸濃度達(dá)到118g/L，產(chǎn)率為3.1g/L/h。（葡萄糖轉(zhuǎn)化率為46%）。
L-蘇氨酸是一種必需氨基酸，添加了L-賴(lài)氨酸以提高動(dòng)物飼料和人類(lèi)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。L-蘇氨酸的生產(chǎn)主要依賴(lài)于大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、黃色短桿菌和谷氨酸棒桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型和調(diào)節(jié)型突變體以碳水化合物為底物的直接發(fā)酵，通過(guò)誘變和基因操作產(chǎn)生的大腸桿菌突變體其生長(zhǎng)速度和生理特性而被使用。分離出大腸桿菌HS3，并優(yōu)化碳源（葡萄糖）和氮源（酵母抽提物）的濃度，以提高產(chǎn)蘇氨酸的能力。用玉米漿浸泡液替代酵母提取物作為氮源，通過(guò)添加生物素作為生長(zhǎng)因子來(lái)增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。在發(fā)酵過(guò)程中，保持最佳發(fā)酵條件很重要，溫度、通氣量、pH值、水分、碳氮源含量以及培養(yǎng)基的C/N比。作為補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的關(guān)鍵因素，初始碳源和葡萄糖投料的分析還沒(méi)有得到系統(tǒng)研究。
菌種：大腸桿菌TRFC
培養(yǎng)基：葡萄糖：90 g/L，KH2PO4：2 g/L，（NH4）2SO4：10 g/L，MgSO4:1 g/L,
FeSO4.7H2O:0.01 g/L，MnSO4.4H2O:0.01。
實(shí)驗(yàn)方法：1.將大腸桿菌接種到含有25ml生長(zhǎng)因子的500ml三角瓶中，31℃，250rpm下培養(yǎng)11h.根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的，接種不同濃度的無(wú)菌種子液。2.pH調(diào)至6.7，然后接種到500ml 三角瓶中，在37℃下在旋轉(zhuǎn)搖床上250rpm培養(yǎng)48小時(shí)。3.采用5L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，每罐接3L培養(yǎng)基，37℃維持溫度，pH 調(diào)至7.0，攪拌設(shè)置在500-800rpm之間,溶氧保持在20%以上。4.當(dāng)初糖耗盡時(shí)，使用800g/L葡萄糖溶液作為進(jìn)料介質(zhì)，打入發(fā)酵罐中，葡萄糖濃度保持在5-20g/L，當(dāng)葡萄糖濃度低于5g /L 時(shí)，溶解氧會(huì)迅速上飄到100%。
①.初始碳源對(duì)蘇迅速氨酸的影響：
葡萄糖、半乳糖、山梨糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖各添加90g/L。
大腸桿菌TRFC具有較高的細(xì)胞生長(zhǎng)率，產(chǎn)生的蘇氨酸比干細(xì)胞重，而麥芽糖和乳糖則比蔗糖產(chǎn)量低，加入蔗糖的蘇氨酸的干細(xì)胞重量和產(chǎn)量最高。當(dāng)葡萄糖作為初始碳源時(shí)，生物量和蘇氨酸產(chǎn)量最低，可能由于大腸桿菌能吸收糖，并在糖運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞后立即啟動(dòng)糖酵解，氧化磷酸化過(guò)程和TCA循環(huán)導(dǎo)致乙酸積累，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，減少蘇氨酸的產(chǎn)生，但蔗糖作為初始碳源時(shí)，它逐漸水解成葡萄糖和果糖，使其對(duì)糖酵解具有相對(duì)的耐受性、另外，蔗糖相對(duì)較低的滲透壓有利于大腸桿菌生產(chǎn)蘇氨酸。
②.蔗糖初始濃度對(duì)蘇氨酸的影響：
為了確定生產(chǎn)蘇氨酸的最佳初始蔗糖濃度，用四種不同濃度的蔗糖作為初始濃度：30g /L、50g /L、70g /L、90g /L。當(dāng)蔗糖耗盡時(shí)，將800g/L 蔗糖溶液注入發(fā)酵罐中，知道發(fā)酵罐中總蔗糖濃度達(dá)到10g/L。結(jié)果顯示，在高初始蔗糖濃度下，蔗糖吸收在培養(yǎng)后期緩慢，13h后開(kāi)始增加，30g /L和50g /L初始蔗糖濃度要用時(shí)9h和10h耗盡，70g /L和90g /L初始蔗糖濃度要用時(shí)14.5h和18h耗盡。大腸桿菌TRFC的生長(zhǎng)速度，在3g /L0和50g /L比70g /L和90g /L快，由于培養(yǎng)基中有足夠的碳源，干細(xì)胞重量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中逐漸增加，但在培養(yǎng)初期增加的速率較高，后期增加速率較低，當(dāng)蔗糖初始濃度為30g /L時(shí)，蘇氨酸的產(chǎn)量在36h達(dá)到峰值，但這個(gè)峰值明顯低于其他初始蔗糖濃度。表明蘇氨酸的產(chǎn)量由細(xì)胞生長(zhǎng)速率和最終干細(xì)胞重量決定。當(dāng)蔗糖初始濃度為70g /L和90g /L時(shí)，蘇氨酸的產(chǎn)量在整個(gè)過(guò)程中不斷增加，當(dāng)蔗糖初始濃度為70g /L時(shí)，蘇氨酸的產(chǎn)量最高，在蔗糖初始濃度為70g /L和90g /L的培養(yǎng)基中，高滲透壓對(duì)大腸桿菌TRFC有抑制作用，蔗糖的消耗導(dǎo)致滲透壓降低，并導(dǎo)致一定生物量的積累，在一定滲透壓范圍內(nèi)，較高的蔗糖濃度促進(jìn)了大腸桿菌生產(chǎn)蘇氨酸，因此最佳初始蔗糖濃度為70g /L。
③.流加方式對(duì)生產(chǎn)蘇氨酸的影響:
采用四種補(bǔ)料分批培養(yǎng)法研究補(bǔ)料培養(yǎng)基對(duì)蘇氨酸生產(chǎn)的影響，當(dāng)70g /L的初始蔗糖耗盡時(shí)，每隔一段時(shí)間向發(fā)酵罐中添加4種不同的碳源，使碳源濃度在10g /L左右，碳源為：蔗糖，葡萄糖、山梨糖、麥芽糖。觀(guān)察蘇氨酸的變化，考慮其成本問(wèn)題最終選擇了葡萄糖作為流加糖。
較高的初始葡萄糖在培養(yǎng)初期會(huì)損害微生物的生長(zhǎng)，較低的初始葡萄糖濃可以縮短接種后微生物生長(zhǎng)的滯后期。
④.葡萄糖濃度和投料方式對(duì)生產(chǎn)蘇氨酸的影響。
三種投料方式：1.恒定濃度10g /L左右。2. 5-20g /L。3.0-35g/L 。葡萄糖在培養(yǎng)14-22h消耗較快，24h后消耗較慢，最大耗糖速率在13g /L/h，然后逐漸下降到恒定值。當(dāng)連續(xù)供應(yīng)進(jìn)料培養(yǎng)基以將慘糖保持在10g /L時(shí)，其余兩種投料方式保持殘?zhí)欠謩e在5-20g /L和0-35g /L范圍內(nèi)振蕩，20h最大耗糖速率為13.9g /L/h。21h最大耗糖速率為12.8g /L/h。5-20g /L投料方式對(duì)葡萄糖的消耗能力最強(qiáng)。
不同投料方式獲得蘇氨酸產(chǎn)量（5.6g /L/h、6.0g /L/h、5.3g /L/h）的時(shí)間約為21h，與最大耗糖速率相對(duì)應(yīng)。在38h時(shí)，蘇氨酸的最高產(chǎn)量為（103g /L、90.2g /L、94.1g /L），與連續(xù)投加相比，生產(chǎn)和使用成本都有較大提高。
⑤.C/N比對(duì)蘇氨酸產(chǎn)量的影響:
硫酸銨和酵母提取物分別是生產(chǎn)蘇氨酸的最佳無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源，對(duì)于發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)胞密度和所需產(chǎn)物濃度的增加，C/N比比氮源濃度更重要，有C/N比培養(yǎng)基，在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，考察C/N比對(duì)蘇氨酸的影響。通過(guò)添加硫酸銨將C/N比分別調(diào)整為10、15、30、50。發(fā)現(xiàn)硫酸銨與蔗糖的最佳配比為30，培養(yǎng)38h后，蘇氨酸最終產(chǎn)量為118g /L，干細(xì)胞重量為27.4g /L產(chǎn)率為3.1g /L/h。
蔗糖初始濃度為70g /L、C/N比為30，間歇投加800g /L葡萄糖，以維持殘?zhí)窃?-20g /L范圍內(nèi)，發(fā)酵38h，蘇氨酸濃度為118g /L/h。轉(zhuǎn)化率為46%，產(chǎn)率為3.1g /L/h。