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hepes緩沖液的主要成分是羥乙基哌嗪乙硫磺酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid），HEPES是一種非離子兩性緩沖液,其在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。其最大優(yōu)點(diǎn)是在開放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的PH值.在這種培養(yǎng)條件下,細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊,以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。
大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH指示劑,酸性培養(yǎng)液呈橙黃色,堿性培養(yǎng)液呈深紅色.HEPES有些昂貴,在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒. 原則上,hepes緩沖液可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制.實(shí)際操作中并非如此簡(jiǎn)單。溶解的CO2與碳酸氫鹽對(duì)良好的細(xì)胞生長也是很重要的。
hepes緩沖液使用方法有兩種：
(1)hepes緩沖液可按所需的濃度直接加入到配制的培養(yǎng)液中,再過濾除菌.每1000ml培養(yǎng)液中加入2.38克HEPES,待溶后用lN NaOH 調(diào)pH至7.2,濾過除菌后使用.此時(shí)HEPES的使用濃度為10 mmol/L.
(2)亦可配成 100 x 貯存液（l mol/L），使用前取 99ml培養(yǎng)液加入 lml貯存液，最終應(yīng)用濃度仍為10mmol/L。l mol/L（100 x）hepes緩沖液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml雙蒸水中,用lN NaOH調(diào)pH至7.5一8.0,然后用水定容至100ml,過濾除菌,分裝小瓶（2ml/瓶）,4℃或-20℃保存.
羥乙基哌嗪乙硫磺酸
1.促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)再礦化的方法，包括以下步驟：
（1）將133mmol/L NaCl溶液加入到50 mmol/L乳酸溶液中，直至乳酸溶液的pH值為4，得 到配置好的乳酸溶液；將2mm×2mm×12mm大小的EBPM-NACP樹脂條放置于50mL配置好的乳 酸溶液中，共放置42天；其中于第7、14、21、28、35、42天分別測(cè)量該乳酸溶液中的Ca、P離子 濃度，得到其初次釋放曲線，即圖1-2；隨后，樹脂條再置于100mL上述配制的乳酸溶液中30 天，使其樹脂條中的Ca、P離子徹底釋放；
（2）將步驟（1）中得到的樹脂條浸泡于5mL CaCl2和HEPES緩沖液構(gòu)成的pH值為7的溶液 中，其中CaCl2終濃度為100mmol/L，HEPES終濃度為50mmol/L，震蕩1min，用去離子水沖洗樹 脂條并于空氣中干燥；對(duì)EBPM-NACP樹脂條進(jìn)行鈣離子“充電”；
（3）將步驟（2）中得到的樹脂條浸泡于5mL K2HPO4和hepes緩沖液構(gòu)成的pH值為7的溶 液中，其中K2HPO4終濃度為60mmol/L，HEPES終濃度為50mmol/L，震蕩1min，用去離子水沖洗 樹脂條并于空氣中干燥；對(duì)EBPM-NACP樹脂條進(jìn)行磷離子“充電”；
（4）重復(fù)步驟（2）和（3）三次，將樹脂條沖洗1min并在空氣中干燥；
（5）將步驟（4）處理得到的樹脂條放置脫礦牙本質(zhì)樣本上，并置于模擬口腔環(huán)境中。
進(jìn)一步的，步驟（5）處理之前還包括以下步驟：將脫礦牙本質(zhì)樣本用濃度為1mg/mL 的端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶液浸泡處理1h；端基為氨基的聚酰胺-胺型樹 枝狀聚合物采用第三代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，簡(jiǎn)稱PAMAM；常溫、常壓下 將10mgPAMAM粉末溶于10ml去離子水中得到1mg/mL的PAMAM溶液；第三代端基為氨基的聚酰 胺-胺型樹枝狀聚合物是以乙二胺為起始核心，反復(fù)與丙烯酸甲酯通過Michael加成反應(yīng)后 再與乙二胺通過酰胺化反應(yīng)制備而成的。
2.制備納米金顆粒
步驟S1：配制濃度為0.05-10mmol/L的氯金酸溶液；
步驟S2：配制濃度為5-50mmol/L的hepes緩沖液，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)hepes緩沖液的PH值至7.0-8.0；
步驟S3：向步驟S2所配制的HEPES緩沖液中添加表面活性劑，配制濃度為1-2mmol/L的表面活性劑溶液；
步驟S4：將步驟S3所配制的表面活性劑溶液引入反應(yīng)池，按氯金酸溶液和表面活性劑溶液的摩爾比為1:1-1:10向反應(yīng)池中緩慢添加步驟S1所配制的氯金酸溶液，并以200-300r/min的速度勻速攪拌，反應(yīng)5-30min，獲得含有納米金膠體的混合液；
步驟S5：將步驟S4所配制的混合液進(jìn)行納米金膠體的干燥提純，獲得納米金顆粒。
以配制200L的濃度為50mmol/L的hepes緩沖液為例，其配置方法為：首先稱取2.38kg的HEPES溶于180L的去離子水中，超聲、振蕩直至完全溶解；然后使用PH計(jì)測(cè)得此時(shí)溶液的PH值約為5.4，于是慢慢添加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液并不斷攪拌直至PH調(diào)整至7.4；最后繼續(xù)添加去離子至200L。
方法1:
直接使用1,2-二氯乙烷作為溶劑，在裝有機(jī)械攪拌、溫度計(jì)的100mL的三口瓶中加入羥乙基哌嗪（5.00g,0.02mol)，碳酸鉀K2CO3（6.00g，0.04mol），50mL1,2-二氯乙烷，油浴加熱90℃（1,2-二氯乙烷沸點(diǎn)85℃），攪拌反應(yīng)20h。停反應(yīng)，過濾，用200mL乙酸乙酯（EA）洗滌濾出的鹽。濾液旋干，得2.6gHEPES固體。
方法二：
在裝有磁力攪拌器、回流冷凝管的三口瓶中依次加入11.0g(84.5mmol)無水亞硫酸鈉、27.0mL（343.6mmol)二氯乙烷、120mL水、110mL乙醇，50mg銅粉，攪拌，油浴加熱升溫到回流。回流22h后，將反應(yīng)液減壓蒸除水，至白色固體全部析出。此固體主要由產(chǎn)物、未反應(yīng)的原料和生成的鹽組成。將所得固體及500mL乙醇加入1L燒瓶中，加熱回流40min。趁熱抽濾，濾液冷卻后，0℃放置過夜。抽濾，真空干燥，得片狀結(jié)晶，產(chǎn)量11.40g，收率81.0％。
在裝有磁力攪拌器、回流冷凝管、溫度計(jì)的四口瓶中依次加入氯乙磺酸鈉（15.10g，0.08mol），羥乙基哌嗪（9.88g，0.075mol），60mL水，油浴105℃攪拌反應(yīng)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)液的pH會(huì)下降，滴加5mol/LNaOH水溶液，控制pH在9左右，共計(jì)加入15mL，再繼續(xù)反應(yīng)5h。
反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液加水稀釋到500mL，上離子交換樹脂柱（約500g）進(jìn)行去鹽純化，反應(yīng)液全部上柱之后，用蒸餾水沖至流出液pH為6，再用1mol/L氨水淋洗，收集TLC檢測(cè)有產(chǎn)物點(diǎn)的流出液（pH約5~9）。旋蒸濃縮至150mL，加入活性炭脫色，油浴110℃，加熱攪拌0.5h，過濾，旋干濾液，加入50mL乙醇，加熱回流0.5h，熱過濾，所得白色固體干燥后為8.63g。濾液滴加冰醋酸，調(diào)pH到5，0℃冷卻過夜，過濾，所得固體干燥后為2.80g。與前述HEPES固體共計(jì)11.43g，收率64.5%。
10mmol/L hepes緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPES 2.383g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。如果用于加入細(xì)胞培養(yǎng)液中作緩沖劑，建議培養(yǎng)液避光保存。
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